Лекция №2.
Что такое IVRT
(in vitro release test)?
(in vitro release test)?
Испытание является регуляторным тестом наружных препаратов.
Мы расскажем о важности данных испытаний и особенностях проведения.
Мы расскажем о важности данных испытаний и особенностях проведения.
Для каких лекарственных форм необходимо проводить оценку высвобождения действующего вещества (IVRT)
Тест in vitro высвобождения является регуляторным испытанием
(Приложение N1, Решение Совета ЕЭК N 85 от 03.11.2016)
(Приложение N1, Решение Совета ЕЭК N 85 от 03.11.2016)
- Следует проводить длямягких лекарственных форм (МЛФ) лекарственных препаратов: мазей, гелей, кремов и суспензий.
- Нельзя проводить дляпростых жидких лекарственных форм в виде раствора, порошков для местного применения, прочих нестандартных лекарственных форм для местного применения (например, пены).
Область применения IVRT
Данное испытание используется как для разработки новых лекарственных форм, так и для регистрационных процедур
Данное испытание может быть выполнено в рамках регистрации воспроизведенных лекарственных препаратов и проведено дополнительно, вместе с другими in vitro исследованиями.
Уже на этапе фармацевтической разработки при помощи данного испытания возможно проводить предварительную оценку скорости высвобождения действующего вещества и корректировать технологию, а также качественный и количественный состав ВВ.
По разработанной и валидированной методике, которая включена в НД возможно осуществлять посерийный контроль качества мягких лекарственных форм.
Испытание IVRT необходимо проводить на специализированных приборах для оценки трансдермальной диффузии
Но для научных целей также допустимо использование тестера растворения, оснащенного лопастной мешалкой (тип аппарат II по ФС ЕАЭС), а также специальным диском. Всё вместе согласно USP называется тип аппарат V - "Лопасть над диском".
диффузионные тестеры
В приборе размещены специальные стеклянные камеры для оценки высвобождения, называемые вертикальные диффузионные ячейки Франца.
Каждая камера состоит из 2-ух частей, между которыми располагается мембрана. Изучаемый препарат наносится поверх мембраны в донорную камеру. Более равномерному процессу диффузии через мембрану способствует перемешивание акцепторной среды при помощи магнитной мешалки.
Отбор и восполнение образцов происходит через специальный носик при помощи микрошприца.
Каждая камера состоит из 2-ух частей, между которыми располагается мембрана. Изучаемый препарат наносится поверх мембраны в донорную камеру. Более равномерному процессу диффузии через мембрану способствует перемешивание акцепторной среды при помощи магнитной мешалки.
Отбор и восполнение образцов происходит через специальный носик при помощи микрошприца.
тестер
растворения
растворения
Для проведения IVRT можно использовать тестер растворения, оснащенный специальным диском. В данном случае необходимо использовать стандартный тип аппарата II "Лопастная мешалка" с модификацей - помещенной на дно сетчатой мембараной.
Несмотря на более высокую распространненость тестеров растворения в лабораториях, серьезным недостатком данного способа испытания является низкая физиологическая релевантность испытания. Помимо этого в Фармакопее ЕАЭС для данного метода среди объектов испытания приведены исключительно трансдермальные пластыри.
Несмотря на более высокую распространненость тестеров растворения в лабораториях, серьезным недостатком данного способа испытания является низкая физиологическая релевантность испытания. Помимо этого в Фармакопее ЕАЭС для данного метода среди объектов испытания приведены исключительно трансдермальные пластыри.
Планирование эксперимента IVRT
Анализ состава основы МЛФ
Основа может влиять на высвобождение действующего вещества. Введение модификаторов высвобождения определяет длительность испытания и частоту отбора проб. Помимо этого, основа может воздействовать на сами мембраны диффузионной ячейки, например, забивая их поры. Кроме того, некоторые типы основ способны проникать через мембрану, образуя эмульсии в акцепторной среде, что затрудняет отбор проб и искажает результаты анализа.
Оценка физ-хим свойств ДВ
При выборе среды проведения испытания стоит учитывать физико-химические свойства изучаемого соединения, для гидрофильных соединений в качестве среды растворения можно использовать различные буферные растворы с pH, близким к физиологическому. Для гидрофобных соединений к буферным растворам зачастую необходимо добавлять ПАВ или органические растворители.
Апробация методики IVRT
Апробация методики IVRT — это важный предварительный этап, цель которого экспериментально проверить, что теоретически выбранные параметры методики не только работоспособны, но и соответствуют требованиям нормативной документации, прежде чем будет проведена процедура полноценной валидации.
Какие базовые условия проведения IVRT?
Выбор условий проведения IVRT обусловлен физиологическими параметрами кожи человека
- Длительность тестаДлительность теста должна учитывать требование по характеризации профиля высвобождения ДВ, рекомендуемое время от 4 до 6 часов
- Среда растворенияДля имитация условий накожного нанесения используется фосфатный буферный раствор со значением рН 7,4 с добавление ПАВ при необходимости
- ТемператураПри проведении испытания температура ячеек зачастую составляет 32°С, что позволяет имитировать температуру кожи человека
- Скорость оборотовСтартовое значение диффузионных ячеек составляет 600 об/мин, требование - выбранная скорость обеспечивает полноценное перемешивание среды
- Процедура отбораВ среднем, объем отбора образцов составляет около
10 - 200 мкл, точек не менее 6 на линейном участке профиля - Размер ячеекДиаметры отверстий и объём акцепторной камеры варьируют и, в среднем составляют для диаметра отверстий от 10 до 30 мм и для объема камеры около 6-12 мл
Проведение эксперимента IVRT
Валидация методики ВЭЖХ
Для количественного определения методом выбора является ВЭЖХ, подходы к валидация методики количественного определения вещества в рамках IVRT строго не регламентированы, поэтому разумно пользоваться подходами к валидации описанными в Решении Совета ЕЭК N85.
Валидация методики IVRT
Данный этап позволяет оценить выбранные параметры методики IVRT, сами подходы подробно описаны в Решении Совета ЕЭК N85.
Выполнение аналитики
На данном этапе проводится непосредственный анализ испытуемых лекарственных препаратов, в случае проведения исследований для установления эквивалентности необходимо что бы тестовые и референтные препараты были проанализированы в рамках одного запуска.
Обработка результатов
В рамках интерпретации полученных результатов оценивается скорость высвобождения действующего вещества (R): тангенс угла наклона линейного участка кривой накопления высвобождаемого действующего вещества и накапливающееся количество высвободившегося действующего вещества (A), выраженное в единицах массы действующего вещества на площадь поверхности высвобождения в последней временной точке взятия образцов. В случае применения расширенной фармацевтической эквивалентности рассчитываются 90% доверительные интервалы для отношения средних значений параметров (R) и (A) для исследуемого препарата и препарата сравнения. Полученный ДИ должен находиться в границах критерия приемлемости, равных 90,00 – 111,00%
Этапы апробации методики IVRT
На этапе апробации необходимо варьировать указанные ниже условия для соблюдения всех регуляторных требований
- Выбор объема нанесенияНа этапе апробации стоит предварительно определиться с массой навески ЛФ, наносимой на мембрану. При выборе стоит опираться на экспериментальные данные и выбрать ту навеску препарата, которая будет обеспечивать соблюдение sink conditions и концентрацию ДВ, достаточную для количественного определения выбранным аналитическим методом.
- Выбор мембарныПри выборе мембран-кандидатов стоит учитывать предполагаемый состав среды испытания и вспомогательные вещества в изучаемой ЛФ, поскольку некоторые мембраны не совместимы с органическими растворителями (как например мембраны на основе целлюлозы) и могут быть чувствительны к определенным диапазонам значений pH. Немаловажно при выборе мембран учитывать размер пор (Стандартный выбор: 0.45 мкм), особенно если речь идет о «больших» молекулах. Ну и конечно же стоит учитывать физико-химические свойства исследуемого соединения и его природу, например для многих типов мембран характерно от среднего до высокого связывание с белками.
- Отбор пробОтбор проб является важным этапом при апробации методики. Необходимо определить регламент отбора проб, объем отбираемой пробы, оценить необходимость процедуры разбавления полученной пробы.
- Длительность тестаПри определении длительности пилотных испытаний необходимо соблюдать баланс между выполнением регуляторного критерия (не менее 70% высвобождения действующего вещества в последней точке) и минимизацией трудоемкости анализа. Стандартная продолжительность тестирования обычно составляет 6 часов, однако при условии достижения требуемого процента высвобождения возможно сокращение времени до 4 часов. Проведение испытания за более короткий период требует предоставления убедительных экспериментальных данных, подтверждающих соответствие всем установленным критериям.
- Скорость оборотовЧаще всего скорость 600 об/мин является стандартной скоростью при проведении испытания. Если это применимо и технически возможно подбирается рабочая скорость перемешивания, при условии, что оно обеспечивает полноценное перемешивание среды проведения испытания.
Валидационные параметры методики IVRT
Данный параметр подтверждает, что выбранная мембрана не выступает ограничивающим фактором при высвобождении ДВ, совместима с ДВ и его не связывает.
Данный параметр подтверждает, что среда не выступает ограничивающим фактором при высвобождении ДВ.
Для выбора временных точек проводится пилотный запуск IVRT с использованием ранее отобранных мембран-кандидатов. Выбранные точки должны соответствовать следующим критериям:
- Отбор не реже чем раз в час;
- Необходимо получить по меньшей мере 6 временных точек на линейном отрезке профиля высвобождения действующего вещества, включая первый образец;
- К концу теста должно высвободиться не менее 70% от нанесенного действующего вещества.
- Отбор не реже чем раз в час;
- Необходимо получить по меньшей мере 6 временных точек на линейном отрезке профиля высвобождения действующего вещества, включая первый образец;
- К концу теста должно высвободиться не менее 70% от нанесенного действующего вещества.
Для валидации точности и прецизионности нанесения пробы два оператора независимо выполняют не менее 5 нанесений в два разных дня. Массу каждой пробы измеряют аналитическими весами.
Оценка дискриминативной способности методики проводится по трём параметрам: чувствительности, специфичности и селективности. Методика признаётся дискриминативной только в том случае, если все три параметра соответствуют установленным критериям приемлемости.
Для оценки селективности используются две дополнительные лекарственные формы с модифицированным содержанием действующего вещества (ДВ): с концентрацией ~50% и ~150% от номинальной.
Для оценки селективности используются две дополнительные лекарственные формы с модифицированным содержанием действующего вещества (ДВ): с концентрацией ~50% и ~150% от номинальной.
Для оценки данного параметра выполняют пилотные запуски на 12 ячейках и оценивают RSD по параметру скорость высвобождения внутри одного дня и между двумя запусками, выполненными в разные дни разными операторами. Критерий приемлемости: -10% ≤ RSD, % ≤ 10%. Между днями можно увеличить критерий приемлемости до ±15%.
При выборе параметров, по которым будет оцениваться робастность методики IVRT, стоит учесть особенности, связанные с используемым оборудованием и самой разработанной методикой. К наиболее распространенным относятся:
- Изменения температуры (например, -1°C и +1°C относительно 32°C ± 1°C);
- Изменения объема дозы (например, +10% и -10% объема дозы);
- Изменения состава среды проведения испытания (например, незначительное изменение состава и/или pH);
- Изменения скорости перемешивания (например, небольшое изменение скорости перемешивания, если применимо).
- Изменения температуры (например, -1°C и +1°C относительно 32°C ± 1°C);
- Изменения объема дозы (например, +10% и -10% объема дозы);
- Изменения состава среды проведения испытания (например, незначительное изменение состава и/или pH);
- Изменения скорости перемешивания (например, небольшое изменение скорости перемешивания, если применимо).
Обработка полученных результатов IVRT
На основании полученных данных при проведении IVRT строятся профили высвобождения ДВ из ЛФ в координатах зависимости количества высвободившегося действующего вещества в единицах массы на единицу площади мембраны в зависимости от квадратного корня из значения времени высвобождения действующего вещества.
Для полученных графиков проводится линия тренда (линейная) вида y=kx+b, где коэффициент к является скоростью высвобождения действующего вещества (R). Вторым параметром, по которому оцениваются профили, является накапливающееся количество высвободившегося действующего вещества (A), выраженное в единицах массы действующего вещества на площадь поверхности высвобождения в последней временной точке взятия образцов.
После того, как необходимое количество испытаний было проведено необходимо с помощью расчета 90% доверительных интервалов оценить эквивалентность профилей. Для этого для каждого из параметров R и A находится отношение данного параметра тестового препарата к референтному, оценивается среднее значения и границы доверительного интервала.
Для полученных графиков проводится линия тренда (линейная) вида y=kx+b, где коэффициент к является скоростью высвобождения действующего вещества (R). Вторым параметром, по которому оцениваются профили, является накапливающееся количество высвободившегося действующего вещества (A), выраженное в единицах массы действующего вещества на площадь поверхности высвобождения в последней временной точке взятия образцов.
После того, как необходимое количество испытаний было проведено необходимо с помощью расчета 90% доверительных интервалов оценить эквивалентность профилей. Для этого для каждого из параметров R и A находится отношение данного параметра тестового препарата к референтному, оценивается среднее значения и границы доверительного интервала.
Для этого для каждого из параметров (R) и (A) находится отношение данного параметра тестового препарата к референтному, оценивается среднее значения и границы доверительного интервала. Препараты признаются эквивалентными если 90%-й доверительный интервал для отношения средних значений параметров (R) и (A) для исследуемого препарата и препарата сравнения должен находиться в границах критерия приемлемости, равных 90,00–111,00%.
Эквивалентные результаты
Полученные 90% интервалы соответствуют требованиям Решения Совета ЕЭК N 85.
90%-й доверительный интервал для отношения средних значений параметров (R) и (A) для исследуемого препарата и препарата сравнения лежит в границах критерия приемлимости равных 90,00–111,00%.
Также на всём протяжении профиля наблюдается линейность.
90%-й доверительный интервал для отношения средних значений параметров (R) и (A) для исследуемого препарата и препарата сравнения лежит в границах критерия приемлимости равных 90,00–111,00%.
Также на всём протяжении профиля наблюдается линейность.
Неэквивалентные результаты
Полученные данные не соответствуют требованиям Решения Совета ЕЭК N 85.
На всём протяжении профиля отмечена линейность, но полученные результаты
90%-ых доверительных интервалов не укладываются в критерии приемлимости равный 90,00–111,00%.
На всём протяжении профиля отмечена линейность, но полученные результаты
90%-ых доверительных интервалов не укладываются в критерии приемлимости равный 90,00–111,00%.
На этом наша вторая лекция завершается
В случае возникновения вопросов по лекции, дополнений по содержанию, предложений по сотрудничеству просьба обратиться к нам, мы будем рады!